1. Editado por Anthony A. James, de la Universidad de California, Irvine, CA, y aprobado 24 de febrero 2015 (recibido para revisión 06 de febrero 2015)

Significado

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Los mosquitos son vectores de ambos parásitos y virus responsables de enfermedades de alto impacto como la malaria, el dengue y el chikungunya. Intervenciones en novela basada en la modificación genética del genoma del mosquito se están desarrollando e implementando actualmente. Para explotar exhaustivamente este tipo de intervenciones, se requiere un conocimiento detallado de la fisiología de mosquitos, la genética y la ingeniería del genoma.

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Hemos desarrollado y validado un proceso de dos pasos para llevar a cabo la inserción específica de sitio de alta eficiencia de material genético en el genoma del mosquito mediante la evaluación de candidatos primera nucleasas específicas del sitio en un formato rápido, seguido de edición basada en la línea germinal donde la elección de DNA es respuesta de reparación y está limitado. Este modelo debería acelerar significativamente tanto la investigación relativa a los mosquitos básicos y aplicados de vectores de enfermedades.

Abstracto

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Las estrategias de control convencionales para los patógenos que son transmitidos por mosquitos, como la malaria y el dengue están siendo complementadas por el desarrollo de cepas de mosquitos transgénicos reprogramadas para generar fenotipos beneficiosos tales como la esterilidad condicional o la resistencia a patógenos. El éxito generalizado de nucleasas específicas de sitio, tales como las nucleasas de transcripción del tipo activador de efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (de CRISPR) / Cas9 en organismos  el modelo también sugiere que los sistemas de accionamiento gen reprogramables basados ​​en estas nucleasas pueden ser capaces de propagar tales fenotipos beneficiosos en las poblaciones de mosquitos silvestres. Utilizando el mosquito Aedes aegypti , se determinó que las mutaciones en el dominio FokI utilizado en Talens para generar complejos heterodiméricos obligados sustancialmente y reducir significativamente las tasas de edición de genes.

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Encontramos que CRISPR / edición basada en Cas9 en el mosquito Ae. aegyptitambién es muy variable, con la mayoría de los RNAs guía incapaz de generar edición detectable. Mediante la evaluación de primera guía RNAs siendo candidato utilizando un ensayo de embrión transitoria, hemos sido capaces de identificar rápidamente guía RNAs altamente eficaces; centrándose experimentos basados ​​en la línea germinal sólo en esta cohorte resultó en consistentemente altas tasas de edición de 24-90%. La microinyección de ARN de doble cadena dirigidos Ku70 o lig4 , ambos componentes esenciales de la respuesta final de la unión, el aumento de la reparación basada en la recombinación en los embriones tempranos como se determina por los reporteros basados ​​en plásmidos.

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Supresión basado en RNAi de Ku70 concurrente con la microinyección de embriones de nucleasas específicas de sitio produjo consistentes frecuencias de inserción génica de 2-3%, similar a transposon- tradicional o métodos de integración basados ​​en C31, pero sin el requisito de un paso inicial de acoplamiento. Estos estudios deben acelerar en gran medida las investigaciones sobre la biología del mosquito, agilizar el desarrollo de cepas transgénicas para las liberaciones de campo, y simplificar la evaluación de los sistemas de transmisión de genes novedosos basados ​​en Cas9.

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Fuente:

http://www.pnas.org

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